تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
Polymerase chain reaction
-----------------------------------------
* تفاعل البوليميرز المتسلسل ( PCR )
تحليل الـ PCR أو مايعرف بإسم “تحليل تفاعل البوليمراز المتسلسل أو تحليل تفاعل البلمرة التسلسلي Polymerase chain reaction ” ليعتبر بذلك هذا التحليل هو طريقة دقيقة جدًا للكشف عن وجود فيروس سي أو غيره من الفيروسات في الدم، ويمكن من خلاله تحديد كمية الفيروس لمتابعة نشاطه وسير العلاج حتى تمام التعافي من المرض.
حيث يستخدم هذا التحليل في تحديد الكائنات المسببة للأمراض وخاصة تلك التي يصعب زراعتها مثل فيروس نقص المناعة البشرية والفيروسات الأخرى وبعض الفطريات إلى جانب غرضه الأساسي في الكشف عن إلتهاب الكبد سي ويكون ذلك من خلال عمل إختبار كمي لفيروس سي الذي يدل عن وجود الفيروس من عدمه، مع اختبار النمط الجيني الفيروسي لمعرفة أي نمط جيني للفيروس هو المسئول عن التهاب الكبد والذي يوجد 6 أنماط منه لفيروس سي.
- وهى عبارة عن تقنية تقوم بعمل نسخ عديدة لجزء محدد من الـ DNA .
تم ابتكار هذه الطريقة بواسطة العالم الامريكي والحائز على جائز نوبل كاري ميليس عام 1983 .
تكمن الطريقة عبر التنقل بين درجات حرارة متفاوتة وبشكل مستمر وباستخدام عدد من المواد التي تساعد في عملية التضخيم (amplification ) .انزيم (TAG polymerase) يعمل في درجة حرارة عالية ويساعد في تكوين الـ DNA الجديد عبر إضافة النيكليوتايد (dNTPs) .
ايضاُ, يتم استخدام primers لتحديد موقع الجزء المراد نسخة من على الـ DNA .
* مراحل الـ PCR :-
1- الانفصال (denaturation ) :-
- يتم خلالها فصل الـ DNA الى شريطين منفصلين عبر تكسير الروابط الهيدروجينية .
2- الالتحام (annealing) :-
- ارتباط primers بالشريطين المنفصلين .
3 - التمدد (extension) :-
- يقوم TAG polymerase بإضافة dNTPs الى الجزء المرتبط بالـ primer وعمل شريط ثناتي .
-
*بعد كل مرحلة (cycle) يكون الجزء المحدد أو الجين (gene) المراد نسخة قد تضاعف .
* في حالة RNA , فإنه يحتاج الى عملية إضافية لتحويلة الى شريطين وتسمى هذه الخطوة بـ Reverse Transcription .
* يتم الكشف عن ناتج PCR عبر تقنية الرحلان الكهربائي كخطوة اضافية تتم بعد انتهاء عملية النسخ . لكن في حالة RT-PCR , يتم الكشف عن ناتج الـ PCR بينما تكون عملية النسج جارية . لهذا يسمى بـ (Real Time (RT .
------------------------------------------
* Real Time -PCR :-
- يتميز هذا النوع بأنه يمنح الفرصة لمتابعة تقدم عمليه النسج وقت حدوثها . تكمن الطريقة عبر استخدام جزيئات مشعة (fluorescent dyes) تسمى بـ probe ترتبط سواءً بالـ DNA أو بالجزء المراد نسخة . تعتبر مقدرة هذا النوع اعلى في الكشف عن الكميات القليلة من الـ DNA الموجودةفي العينة من تقنية الرحلان الكهربائي . كلما ازداد اشعاع الجزيات المشعة كلما دل ذلك وجود كميات اعلى من الـ DNA .
*بعض انواع الجزيأت المشعة :
-----------------------------
* استخدامات RT-PCR :-
- الكشف عن الميكروبات وتحديد كمياتها
- الكشف عن الطفرات الجينية
- تحديد النمط الجيني (genotyping)
* الفرق بين probe و primer ؟
– النيكليوتايد عبارة عن وحدة بناء الحمض النووي بحيث يكون DNA مكون من سلسلة متصلة من النيكليوتيدات .
يوجد اربع انواع من النيكليوتايد في DNA وتختلف وفقاً لنوع القاعدة النيتروجينية (A ,T ,C,G) .
معرفة ترتيب النيكليوتيدات أو ما يسمى بـ (sequence) اصبح ذو فائدة كبيرة سواءً في تشخيص العديد من الامراض الاوراثية أو الكشف عن الميكروبات .
يتكون DNA من شريطين متوازيين متكاملين ( كل نيوكليوتايد في الشريط الاول يقابله نيوكليوتايد محدد ومعروف في الشريط الآخر) .
عند انفصال الشريطين , تصبح فرصة الارتباط بالشريط الوراثي ممكنة وهذا ما يحدث بالنسبة لـ Probe و Primer .
يتشابهة probe و primer بأنهما عبارة عن شريط واحد من DNA ( سلسلة محددة من النيكليوتيدات ) تختلف في حجمها وفقاً لأغراض مختلفة . كلاهما يعملان على الارتباط بالجزء المكمل على شريط DNA .
يختلف هذان المصطلحان من ناحية استخدامهما فمصطلح probe يكون الهدف منه الكشف عن الحمض النووي لذلك عادةً ما يتم ارتباط Probe بمواد تساعد على التعرف عليه كالمواد المشعة . أما مصطلح primer فيقصد به تحديد بداية تصنيع الحمض النووي على الشريط الوراثي لأن انزيمات البوليميراز لا تستطيع بدء بناء شريط وراثي جديد ما لم يتم البدء بتحديد مكان البداية وهذا يكون عمل primer .
* مصطلحات مهمة في RT-PCR :-
- Threshold :-
- عبارة عن كمية الاشعاع المطلوبة الصادرة من العينة والتي يتم استقبالها عبر المستقبلات . تعتبر هذه الكمية قليلة وهذا مايجعلها اكثر حساسية من تقنية الرحلان الكهربائي .
- threshold cycle :-
- هي الدورة التي تم الكشف عن الاشعاع فيها . فإذا كانت TC قليلة , فهذا يدل على أن
كمية DNA عاليةوالعكس صحيح .
ليست هناك تعليقات:
إرسال تعليق